色素在藻類生理中起著關(guān)鍵作用，驅(qū)動光合作用、光保護和應(yīng)激反應(yīng)。色素差異不僅幫助細胞適應(yīng)環(huán)境條件，還可作為基于獨特色素組成的分類標記。藻類色素分析傳統(tǒng)上依賴于高效液相色譜，無法實現(xiàn)單細胞維度的精確分析。相比之下，全光譜流式細胞術(shù)已成為一種高通量、單細胞的替代方法，不僅提供細胞大小和散射光信息，同時在多個激發(fā)波長下捕獲完整的自發(fā)熒光（AF）光譜。來自納扎爾巴耶夫大學(xué)的研究者，已成功將索尼ID7000全光譜流式分析儀引入到合成藻類-微生物群落分析的研究領(lǐng)域，利用色素的光譜變異性，實現(xiàn)了從物種鑒定計數(shù)到群落組成和進化動力學(xué)的高通量分析，極大拓展了全光譜流式技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域（Sony ID7000全光譜流式建立自發(fā)熒光指紋庫，助力藻類-微生物群落生態(tài)學(xué)研究）。

在此基礎(chǔ)上，研究團隊深入挖掘色素光譜變異性，發(fā)現(xiàn)藻類色素的多樣性通過初級和次級內(nèi)共生等進化過程形成，揭示了不同藻類譜系的出現(xiàn)與其獨特色素組成，展示全光譜流式技術(shù)在研究微藻多樣性、識別表型光譜特征、檢測代謝適應(yīng)性以及高分辨率單細胞維度分析領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用前景。

是否表達藻膽蛋白（PBP），是微藻譜系分類的重要標志。作者通過分析來自9個主要微藻類群的32個代表性物種的AF光譜，發(fā)現(xiàn)含PBP類群（包括藍藻、隱藻、紅藻和灰藻）與不含PBP類群（如綠藻、硅藻、定鞭藻、裸藻和甲藻）在570–600 nm范圍存在顯著光譜特征差異，對應(yīng)于藻藍蛋白和藻紅蛋白的發(fā)射峰。并通過定義三個目標光譜區(qū)域R1（494–566 nm）、R2（566–647 nm）和R3（647–712 nm）），量化光譜差異，驗證含PBP類群在R2區(qū)域表現(xiàn)出更高的熒光強度，表明其可作為可靠的分類特征。

圖1. Sony ID7000記錄9種微藻類群自發(fā)熒光指紋

利用Sony ID7000多達7激光184熒光通道和360-920nm全波長覆蓋的強大光譜檢測配置，研究團隊聚焦于團藻目（Volvocales），探索了該目下102株在生態(tài)和生理特征上具有多樣性的微藻物種，發(fā)現(xiàn)R1和R2區(qū)域CV值顯著高于R3區(qū)域（圖2c）；同時PCA結(jié)合k-means聚類分析揭示存在三個顯著的AF簇，表明團藻目內(nèi)部在色素組成和AF強度方面存在明顯異質(zhì)性（圖2d）。

圖2. 團藻目102種類群的光譜指紋與信號變異分析

盡管成功識別出團藻目獨特聚類，但實驗發(fā)現(xiàn)即便是單一類群培養(yǎng)，微藻也會表現(xiàn)出顯著的AF異質(zhì)性。作者隨后使用索尼MA900多功能流式分選儀對目標類群進行高純度高效分選，發(fā)現(xiàn)單個株系內(nèi)部存在與細胞生長階段及凋亡狀態(tài)相關(guān)的不同AF亞群，其共同特征是葉綠素a (Chl a) 熒光強度遞減。例如衣藻類群可分辨出5個不同亞群（圖3）：A1（單細胞）與A2（分裂期細胞）光譜指紋相似；B、C、D亞群Chl a信號逐步減弱，暗示細胞可能處于生理應(yīng)激狀態(tài)。

圖3. 衣藻群落內(nèi)各狀態(tài)亞群光譜分析

為進一步探究AF與生理狀態(tài)的密切關(guān)系，作者分析了紅球藻在不同條件下的光譜特征（圖4上）。應(yīng)激組因積累蝦青素而呈紅色，其光譜指紋雖在355 nm與405 nm激發(fā)下也有輕微差異，但561 nm激發(fā)下熒光強度顯著升高，最能敏感地反映色素狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。

圖4. 不同生理狀態(tài)（上圖）以及與細菌互作（下圖）狀態(tài)下微藻光譜特征變化

此外，作者通過監(jiān)測15小時內(nèi)微藻-細菌合成群落的時間分辨光譜，發(fā)現(xiàn)9 h起光譜指紋出現(xiàn)顯著漂移（圖4下），證實其合成受特定生長條件誘導(dǎo)，并伴隨pH依賴的光譜特性。由此可見，AF可作為一種非侵入式工具，能夠?qū)崟r追蹤藻類及細菌中色素的合成與代謝變化。